呼伦贝尔境内的煤炭资源丰富，目前已经探明煤炭储量为3.07×104 Mt，远景储量约为1.5×105 Mt以上，该区域煤层厚、倾角小、埋藏浅、构造简单、产状平缓，特别适合露天开采[1]。同时，呼伦贝尔草原面积广阔，草原总面积约100 000 km2，约占全市土地面积的40%，是我国北方重要的生态屏障[2]。露天煤矿开采通过直接剥离表土及煤层上覆岩层，造成大面积草原植被的破坏，而地层开挖和排弃改变了原有土壤层结构，导致重构土层中微生物群落急剧减少、土壤肥力和酶活性下降，土壤质量下降，土地生产力极为低下，严重制约了矿区地表植被的生长和恢复[3-4]。同时，呼伦贝尔草原区处于高寒地区，自然气候条件恶劣，易遭受严寒、干旱灾害，这进一步增加了植被恢复的难度，草原破坏严重威胁了该区域生态安全。因此，采取有效途径在露天矿区排土场进行高效、快速植被恢复与重建，是露天矿生态复垦的紧要任务[5]。
丛枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)广泛分布于自然界和草原生态系统中，能与80%以上高等植物形成丛枝菌根共生体[6]。接种AMF能够有效促进宿主植物生长，改善水分代谢和矿质营养的吸收利用，显著改善土壤质量，同时还能够增强作物的对干旱寒冷、盐碱及重金属等方面抗逆性[7-11]。基于此，利用菌根生物技术进行矿区复垦、退化草原修复，提高宿主在干旱环境中的成活率、抗逆性和植物生产力具有很大的潜力[12-13]。
黄花苜蓿(Medicago falcata L.)为豆科苜蓿属多年生草本植物，广泛分布于亚洲和欧洲。其具有较强的耐瘠薄、抗旱、抗寒能力，对矿区土壤改良具有较好的效果，广泛应用于酷寒、干旱等自然条件恶劣的矿区受损植被的恢复[14]，在我国东部草原区分布较多。近年来，有关黄花苜蓿的研究主要集中在黄花苜蓿的生理生态特征、抗逆性、栽培利用、种质资源等方面[14-17]，针对菌根对矿区黄花苜蓿促生作用研究鲜有报道。笔者以黄花苜蓿为对象，通过接种3种丛枝菌根菌种，比较不同菌根真菌对黄花苜蓿生长的影响，筛选优良高效菌种，为菌根真菌资源的利用提供理论依据，为东部草原矿区生物联合修复提供技术支持。
1 材料与方法
1.1 试验材料
所用黄花苜蓿品种为呼伦贝尔黄花苜蓿，种子由内蒙古农业大学徐军老师提供。所用菌剂为中国矿业大学(北京)微生物复垦实验室增殖扩繁的丛枝菌根菌剂，接种菌剂由菌丝、植物侵染根段、孢子和沙土混合物组成。所选菌种包括摩西管柄囊霉(Funneliformis mosseae，简称F.m)，幼套球囊霉(Glomus etunicatum,简称G.e)，地表球囊霉(Glomus versiforme，简称G.v)，所选菌种均为矿区当地常见优势菌。供试土壤基质为宝日希勒矿区表层土壤，土质为砂质栗钙土，土壤中速效钾含量为145.71 mg/kg，速效P含量13.71 mg/kg，碱解N含量124.37 mg/kg，有机质含量 18.36 g/kg。
1.2 试验方法
实验设接种菌根(+M)和不接种菌根(CK)处理，接菌处理分别为F.m，G.e，G.v，每个处理重复3次，共计12盆。盆栽试验在中国矿业大学(北京)玻璃温室内进行。栽植塑料盆规格为:21 cm(高)，23.5 cm(盆口直径)，15 cm(盆底直径)，基质过2 mm土壤筛，在装盆前经高温高压蒸汽灭菌(121 ℃，2 h)，风干装盆，每盆加土量为3.9 kg，接种处理每盆施对应菌剂50 g，对照处理加同等质量的灭菌菌剂。种植前浇水达到最大饱和持水量，水分平衡后，播种。将黄花苜蓿种子用10% H2O2溶液浸泡10 min做表面消毒，再用去离子水清洗数次，每个盆播种200粒种子，待出苗后间苗，每盆保留80株。利用称重法控制浇水量，每盆土壤含水量维持在最大持水量的75%～80%。
1.3 测定指标及方法
光合生理参数、叶色值(SPAD)、可溶性蛋白测定:收获前，选择晴朗、光照充足的天气(09:00—11:00)，采用Li-6400(COR,USA)光合测定系统测定黄花苜蓿叶片光合参数。选择长势一致、生长健康、叶片位置相同(取植株从上往下数第2片叶子)的苜蓿叶片进行测定，主要测定叶片的净光合速率(Pn)、植株叶片气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)，每盆随机选择3片叶子。测量结束后，摘除叶片，用方格纸测定叶面积，对光合参数计算，得到真实叶面积对应的净光合速率(Pn)及各参数。叶色值(SPAD)采用SPAD-502叶绿素仪(Konica,日本)测定，每盆随机测定5片，取平均值。叶片可溶性蛋白测定采用考马斯亮蓝法测定[18]。
生物量测定:黄花苜蓿生长120 d后分别收获其地上和地下部分，用自来水清洗根系附着的泥土，同时将植物地上部分和根系分开，在105 ℃烘箱内杀青20 min，然后放到80 ℃烘箱内直至烘干。分别称量每盆植株地上部分和根系的干质量。
植物养分测定:样品烘干后磨碎过孔径为0.25 mm筛，用凯氏定氮法测定植物地上和地下部分全氮量;植物全P测定采用H2SO4-H2O2消煮，用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)测定叶片全P[19]。
菌根侵染率和菌丝密度的测定:随机取少量新鲜细根样，采用质量分数10% KOH浸泡24 h，随后用清水冲洗干净，再用曲利苯蓝染色，将根系剪成1.0～1.5 cm的根段，随机选取15根制片，显微镜下观察侵染根段数，依据被侵染根段数占观察根段数比值计算菌根侵染率[20]。菌丝密度采用真空泵微孔滤膜抽滤-网格交叉法测定[21]。
相关公式如下:
菌根侵染率=感染根段数/总根段数×100%;
菌根依赖性(%)=接种处理干重/不接种处理干重×100。
1.4 数据处理
采用Excel 2013软件处理数据，使用Origin2017进行绘图。试验数据通过SAS 8.0进行统计分析，采用单因素方差分析法(one-way ANOVA)进行方差分析，显著性水平选择α=0.05。
2 结果与分析
2.1 不同接菌处理对植物生长的影响
接菌显著增加了黄花苜蓿株高，F.m，G.e，G.v较对照分别增加了23.5%，20.9%，9.9%，且差异显著(P<0.05)(表1)。接种菌根后植株地上生物量均有所增加，与对照相比，F.m，G.e，G.v处理地上生物量分别提高51.7%，32.8%，18.2%。F.m，G.e处理地下生物量高于对照，较对照分别提高了23.9%，14.8%。总干重表现为F.m>G.e>G.v>CK，接菌处理较对照分别提高34.1%，21.5%，3.5%(表1)。方差分析表明，接菌后F.m，G.e处理地上生物量显著高于对照处理，F.m总干重显著高于对照处理(P<0.05)。接菌后黄花苜蓿植株的菌根依赖性增强，表明菌根有效促进了黄花苜蓿的生长。黄花苜蓿的菌根依赖性表现为F.m>G.e>G.v。不同菌株促生效果存在差异，整体来看，F.m对生物量的促进作用最为明显，G.e次之，G.v效果略差。
表1 接种菌根对植株生长的影响
Table 1 Effects of different treatments on plant growth
处理株高/cm地上生物量/g地下生物量/g总干重/g菌根依赖性CK9.13±0.42c1.81±0.15c3.10±0.19ab4.91±0.34b0F.m11.87±0.31a2.75±0.23a3.84±0.37a6.59±0.49a134G.e11.47±0.42a2.40±0.07ab3.56±0.28ab5.96±0.36ab121G.v10.07±0.68b2.14±0.16bc2.94±0.15b5.08±0.28b103
注:数值为均值±标准误差，同列不同小写字母表示不同处理在0.05水平上有显著差异，下同。
2.2 不同接菌处理对侵染率和菌丝密度的影响
接菌后菌根侵染率显著提高，表明3个菌种均可与黄花苜蓿形成良好的共生关系(图1)。不同接菌处理侵染率表现不同，可能是由于宿主植物与菌种之间存在相互选择作用，其中F.m表现为最高，达到66.7%，所有接菌处理与CK相比均表现为显著差异(P<0.05)。菌根侵染后，根围会产生大量的菌丝。与对照相比，F.m，G.e，G.v分别达到6.4，5.8，3.4 m/g。菌丝的增加可以增大根系吸收面积，有效促进土壤中水分和养分的吸收，有利于植物的生长[22]。
图1 不同接菌处理菌根侵染率、菌丝密度
Fig.1 Effects of different treatments on infection rate of plant root and soil mycelium density
2.3 接菌对植株叶片可溶性蛋白、叶色值的影响
叶片可溶性蛋白是植株代谢的重要物质，可延缓或者减少植株体内RNA降解，增强非酶促防御系统能力，提高寄主细胞的保水能力，对于植物逆境条件下保持较高生理代谢具有重要作用[23]。由图2可知，接种菌根后叶片可溶性蛋白含量较对照增加，表现为F.m>G.e>G.v，3者分别较对照提高36.8%，14.7%，7.1%，其中F.m，G.e处理显著高于对照(P<0.05)。叶绿素作为参与植株光合作用的重要物质，其浓度提高可以促进植株光合效率的提高和光合产物的合成，有利于植株干物质的积累。SPAD值能够反映植株叶片中叶绿素含量，接菌后植株SPAD值显著提高(P<0.05)，与对照相比，分别提高21.0%，17.6%，20.6%。
2.4 接种菌根对植株光合作用参数的影响
植株光合作用是通过能量转化，利用光能将无机物变为有机物，为植物自身和自然界其他生物提供有机物。净光合速率、气孔导度、蒸腾速率等指标可从植物光合生理角度反映植物对丛枝菌根的响应[24]。由表2可知，接种菌根后叶片的净光合速率(Pn)高于未接菌处理，F.m，G.e，G.v较对照分别提高19%，7.0%，7.6%。接菌可有效提高叶片气孔导度(Gs)，表现为F.m>G.e>G.v>CK，较对照分别提高38.6%，18.5%，4.9%。接菌后植物叶片蒸腾速率(Tr)有所增加，F.m，G.e，G.v较对照分别提高22.9%，16.7%，5.3%。方差分析表明，F.m处理显著提高叶片净光合速率、气孔导度、蒸腾速率(P<0.05)，促进作用明显，而G.e仅表现为蒸腾速率显著优于对照，其他指标虽表现为促进，但差异不显著(P>0.05)。G.v促进作用不明显，与对照相比差异均不显著(P>0.05)。
图2 接种菌根对植株叶片SPAD值和可溶性蛋白的影响
Fig.2 Effects of different treatments on SPAD value and soluble protein content 注:图中数据为3次重复的均值±标准差。不同小写 字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)。
表2 接种菌根对黄花苜蓿叶片光合作用参数的影响
Table 2 Effects of different treatments on photosynthetic parameters
处理净光合速率气孔导度蒸腾速CK14.24±0.04b0.11±0b2.81±0.08bF.m16.94±0.78a0.15±0a3.45±0.12aG.e15.24±0.28ab0.13±0.01ab3.28±0.11aG.v15.32±0.78ab0.12±0b2.96±0.03b
注:净光合速率单位为(μmolCO2·(m2·s)-1));气孔导度单位为(molH2O·(m2·s)-1);蒸腾速单位为(mmolH2O·(m2·s)-1)。
2.5 接菌对植株养分含量的影响
接种后，F.m，G.e，G.v处理的黄花苜蓿地上部分N元素质量分数均小于对照处理，表现为CK>G.e>F.m>G.v(图3)。地下部N含量表现为G.v>CK>G.e>F.m，但对照与接菌处理间差异均不显著(P>0.05)。植物地上部分和根系的植物P营养均表现为接菌大于对照处理。其中地上部分P含量表现为G.e>G.v>F.m>CK，较对照分别提高34.1%，7.5%，0.4%，但差异不显著(P>0.05)。根系P含量表现为G.e>F.m>G.v>CK，接菌处理均显著高于对照(P<0.05)。接菌后对植物N含量的响应不明显，这可能是由于植物生长的稀释效应。接菌有效促进了植物对P的吸收，这可能是由于植物与菌根结合后促进了植物根系对土壤中养分的吸收利用[7]。不同接菌处理对于植物营养元素的吸收表现不同，这可能是由于菌根在根系的侵染位点和作用时间及作用机制不同。
2.6 菌根侵染与植物生长、光合作用参数等相关性分析
相关性分析表明(表3)，菌根侵染率与生物量、叶片可溶性蛋白、气孔导度、地上部分N含量呈显著相关，与菌丝密度、株高、蒸腾速率、根系P含量呈极显著相关，菌丝密度与生物量、气孔导度、蒸腾速率呈显著相关，而与SPAD、可溶性蛋白、株高、净光合速率、地下P含量呈极显著相关。表明菌根侵染后显著提高了植物株高和生物量，同时促进了植物体对土壤养分的吸收，改善了植物光合代谢，菌根对植物的生长起到显著促进作用。
图3 接种菌根对植株养分的影响
Fig.3 Effects of different treatments on plant N and P nutrients
表3 菌根侵染、植物生长、光合作用参数相关性分析
Table 3 Correlations between infection rate,external hyphal density,plant growth and photosynthetic parameters
项目侵染率菌丝密度SPAD生物量可溶性蛋白株高净光合速率气孔导度蒸腾速率地上N含量地下N含量地上P含量菌丝密度0.74∗∗SPAD0.440.73∗∗生物量0.68∗0.70∗0.30可溶性蛋白0.68∗0.80∗∗0.61∗0.79∗∗株高0.73∗∗0.92∗∗0.64∗0.79∗∗0.81∗∗净光合速率0.440.75∗∗0.70∗0.510.79∗∗0.68∗气孔导度0.68∗0.66∗0.58∗0.550.83∗∗0.75∗∗0.54蒸腾速率0.79∗∗0.74∗0.550.64∗0.76∗∗0.82∗∗0.460.95∗∗地上N含量-0.63∗-0.47-0.44-0.53-0.37-0.34-0.17-0.21-0.34地下N含量-0.31-0.55-0.16-0.76∗∗-0.66∗-0.64∗-0.35-0.46-0.480.26地上P含量0.070.300.36-0.13-0.030.350.030.250.330.270.07根系P含量0.77∗∗0.82∗∗0.490.60∗0.570.72∗∗0.340.63∗0.80∗∗-0.56-0.430.37
注:**表示在 0.01 水平上相关性显著，*表示在 0.05 水平上相关性显著。
2.7 接菌促生效应主成分分析
通过对菌根侵染及植物生长、生理、营养状况等指标进行主成分分析，选取了2个主成分。其中第1主成分反映信息占总信息量的75.04%，第2主成分占13.33%，累积贡献率达到88.37%(表4)。第1主成分主要综合了菌根侵染、植物生物量、株高、植物根系P含量、光合作用等指标的变异信息，第2主成分主要包含了地上N含量的变异信息，可表征为植物生长、营养状况和菌根作用的量度。由综合得分及排名分析可知(表5)，3种接菌处理中F.m得分最高，促进作用最好，G.e次之，G.v表现较差。F.m的应用潜力较大，可优先作为后续微生物菌肥应用。
表4 主成分载荷矩阵、特征值与贡献率
Table 4 Principal component loading matrix,eigenvalue and contribution rate
项目第1主成分第2主成分侵染率0.950.16菌丝密度0.980.19SPAD0.830.53生物量0.95-0.31可溶性蛋白0.92-0.30株高0.99-0.05净光合速率0.91-0.11气孔导度0.94-0.33蒸腾速率0.98-0.17地上N含量-0.64-0.72地下N含量-0.720.55地上P含量0.300.40根系P含量0.900.27特征值9.7561.733贡献率/%75.0413.33
表5 不同接菌处理植物生长效应综合得分及排名
Table 5 Comprehensive score and ranking of plant growth effects with different inoculation treatments
处理第1主成分第2主成分综合得分排名F.m1.071-0.7570.7951G.e0.2980.2980.2982G.v-0.2811.286-0.0453CK-1.250-0.828-1.1864
3 讨 论
呼伦贝尔草原地处内蒙古高原东部的高寒地区，该区域生态极其脆弱，气候条件恶劣，无霜期短，易遭受寒灾、旱灾，一旦受损退化，极难恢复。该区域露天采矿活动造成地表土壤结构破坏，土壤肥力下降，微生物数量和活性降低，对植物生长非常不利[6]。而菌根修复技术在解决矿区植被和土壤退化、提高植物抗逆性、生态系统恢复重建等方面可起到重要作用[7,10]。
N和P是植物进行生理代谢必需的大量元素，在光合与呼吸、生物膜的合成与稳定、酶的活化与失活、信号转导、产量与品质形成等过程中发挥重要作用[25]。研究表明，N，P的缺失会导致光合作用能力的下降，限制植物的生长和正常代谢。研究区本身土壤瘠薄，由于煤炭开采，造成了土壤养分和水土流失，对植物的生长造成一定的消极影响。而接种菌根后显著提高了植物体内养分含量尤其是P，这可能是由于接菌后根系周围产生了大量的菌丝，增加了根系的吸收面积。这一研究与陈梅梅等[26]在接种菌根促进黑麦草植株体内营养浓度的结论相一致。可溶性蛋白是植物进行渗透调节的重要物质，可使植物在逆境条件下保持较高的生理代谢，对植物的抗逆性有重要作用[23]。研究表明，可溶性蛋白含量与植物的抗旱、抗寒性密切相关。本研究发现，接种菌根显著提高了黄花苜蓿叶片的可溶性蛋白含量，其对于黄花苜蓿叶片生理代谢进行具有重要意义，且可有效提高植物的抗逆性，研究结果与刘欢等一致[27]。
光合作用是植物同化作用进行干物质积累的主要方式途径。影响光合作用的环境因素较多，如光强度、CO2浓度、温度、水分、矿质营养、叶绿素含量等[28]。呼伦贝尔地区由于处于中高纬度地区，生长季短，且容易遭受干旱和低温严寒胁迫，如何有效提高植物光合作用效率、充分利用光能是提高其土地生产力，促进植物恢复的关键。在外界环境条件一定的情况下，提高植物叶绿素含量、增强植物体内水分和营养状况是提高植物光合作用效率的有效手段。已有研究表明，接种菌根能够有效促进植物在低温、干旱等环境胁迫条件下光合作用效率，促进植物干物质的积累[29]。本研究中接种菌根显著提高了植株叶片SPAD值，植株养分含量也得到有效提高，一定程度上对于植物光合作用的提高和干物质的积累具有重要作用，实际测定结果也证明了这一点。相关性分析亦表明，净光合速率与SPAD、株高均呈显著正相关，与菌丝密度、叶片可溶性蛋白呈极显著正相关。菌根通过促进植物对土壤水分和养分的吸收，提高了植物体内的养分浓度，促进了叶片的代谢和叶绿素合成，从而有效促进植物光合作用和干物质的积累。接种菌根后有效促进了植物净光合速率、气孔导度、蒸腾速率，这对于高寒地区的植物生长和植被恢复具有至关重要的作用，体现出菌根真菌的生态价值。研究结果与ZHANG对AM真菌对黑麦草光合作用影响的研究结果一致[11]。
本研究通过室内盆栽模拟实验，分析对比了不同菌种的有效性，表明接种菌根能够有效促进黄花苜蓿幼苗的生长，提高植物叶片叶绿素和可溶性蛋白含量，提高植物净光合速率和对营养的吸收。研究主要在温室内土壤灭菌条件下进行，对于在逆境条件下(干旱、严寒等环境)的作用效果以及矿区实际环境条件与土著微生物的长期互相作用有待于进一步研究。
4 结 论
(1)3种接菌处理对黄花苜蓿幼苗生长均有不同程度的促进作用，其中以F.m的效果最好，G.e次之，G.v效果最差。综合各形态、生理指标来看，F.m对幼苗生长的促生效果最好，具有菌肥开发的潜力。
(2)接种菌根能与黄花苜蓿形成良好共生关系，显著提高了根际菌丝密度，并能促进植物生长，接种菌根处理显著促进了植物株高和生物量的增加。
(3)接种菌根有效提高了叶片和根系P含量，提高了黄花苜蓿净光合速率、气孔导度、蒸腾速率，同时提高了叶片SPAD值和可溶性蛋白，对于矿区逆境的抗性具有潜在作用。
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